• 《食品安全導刊》刊號:CN11-5478/R 國際:ISSN1674-0270

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    利用PCR法檢測熟牛肉的肉源性

    2020-05-14 16:55:40 來源: 食品安全導刊

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    □ 賈南南 李建平 范美霞 菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院

    摘 要:本文旨在建立實時熒光PCR檢測熟牛肉中牛、豬、馬等動物源性成分的方法。通過對菏澤市市售熟牛肉進行采樣檢測,提取熟牛肉中總DNA后進行實時熒光PCR檢測,確定Ct值,分析樣品熟牛肉中牛、豬、馬源性成分。通過檢測DNA提取液(純度1.6~1.7),便能滿足實時熒光PCR的檢測要求。本次采樣檢測的12批樣品中,2批既檢出牛源性成分又檢出馬源性成分,說明樣本可能存在馬肉摻假為牛肉的問題。

    1 引言

    隨著社會的發展,人們的生活水平不斷提高,對肉制品的要求也越來越高。但是,肉制品市場存在肉類摻假、以次充好等欺騙消費者的行為,不法商販為了追求自身利益以“掛羊頭賣狗肉”的方式用劣質肉冒充高質量的肉制品。利用常規的檢測方法只能從感官及形態上鑒別肉類,無法從溯源層面解決肉類摻假的問題,例如對于腌制加工的熟牛肉,消費者就很難通過肉眼辨別其是否為牛肉。

    隨著分子生物學的發展,以DNA為基礎的PCR技術被廣泛應用于動物源性成分的檢測[1-4],即聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)溯源是以DNA遺傳物質為基礎鑒別肉及肉制品。聚合酶鏈式反應是一種在體外特異性擴增DNA序列的技術,其基本過程為3個階段的多次循環——模板雙鏈DNA的變性、引物與模板DNA的退火、在DNA聚合酶引導下的鏈延伸反應,且每一次循環后的擴增產物均可作為下一輪循環的模板。就理論而言,擴增產物量呈指數形式上升,即經過n個循環后,產物量增加到2n倍。此方法在動物源性成分檢測、肉類摻假鑒別等應用上已有多個報道[7,8]。本研究針對菏澤市市場上銷售的肉及肉制品進行抽樣檢測,利用實時熒光PCR方法鑒別牛、豬、馬源性成分,以期發現是否存在摻假的情況,旨在為肉制品摻假檢測提供一定的參考依據。

    2 材料和方法

    2.1 材料

    12份市售熟牛肉。

    2.2 儀器

    絞肉機,小熊電器股份有限公司;金屬浴,杭州奧盛儀器有限公司;Rotor Gene Q 熒光定量PCR儀,德國凱杰。

    2.3 試劑

    無水乙醇,天津市富宇精細化工有限公司;DNA提取試劑盒,天根生物公司;豬源性檢測試劑盒、牛源性檢測試劑盒,Takara公司;馬引物及探針(SN/T3730.5-2013)、PCR體系預混液2xTaqMan Fast qPCR Master Mix(Probe qPCR),上海生工合成。

    2.4 樣品處理

    取適量樣品放入燒杯中,用溫水沖洗并擠干水分,往復數次,用干凈的絞肉機粉碎,備用。

    2.5 樣品總DNA提取

    按照DNA提取試劑盒說明書進行操作。

    2.6 DNA純度與濃度

    打開核酸蛋白檢測儀,吸取 DNA溶解液2μL加入加樣口,分別測定260nm與280nm吸光度,測定DNA提取液的濃度和純度。

    2.7 聚合酶鏈式反應(PCR)

    2.7.1牛源性實時熒光PCR反應

    以提取的各個DNA樣品為模板,按牛源性檢測試劑盒說明書操作。

    圖 1 牛源性成分檢測

    2.7.2 豬源性實時熒光PCR反應

    以提取的各個DNA樣品為模板,按豬源性檢測試劑盒說明書操作。

    圖 3 豬源性成分檢測

    2.7.3 馬成分檢測

    以提取的各個DNA樣品為模板,作陽性對照、陰性對照、空白對照。

    反應體系:2xTaqMan Fast qPCR Master Mix 10μL、10μM Forward Prime 0.4μL、10μM Reverse Primer 0.4μL、10μM probe 0.4μL、DNF Buffer 2μL、模板DNA 1μL、dH2O 5.8μL。

    反應條件:預變性94℃3min,變性94℃5s,退火延伸60℃30s(收集熒光信號),40個循環。

    圖 2 馬成分檢測

    3 結果與分析

    3.1 DNA模板質量

    所有樣品DNA提取液OD260/OD280值為1.6~1.7,濃度為50~100ng/μL,模板DNA在純度及濃度上都能夠滿足進行PCR檢測的要求。

    3.2 實時熒光PCR 檢測結果

    分別配制牛、豬源性熒光PCR反應體系和馬成分熒光PCR反應體系,Ct值如表1所示。當樣品的Ct值不為0且小于35,并有典型的擴增曲線時,則判定樣品檢出該動物源性成分;反之則為未檢出該動物源性成分。

    4 討論

    動物源性食品大多為動物組織,其結構緊密,富含蛋白質、脂肪等大分子物質,而熟肉制品在制作過程添加了入味調料等,這些物質會在DNA提取過程中產生共沉淀,倘若提取不當將會影響后續PCR檢測。因此,在提取DNA的過程中,去除雜質,得到高DNA純度尤為重要。本方法在前處理時用溫水多次洗滌,去除入味的香料和鹽等成分,DNA提取采用試劑盒介質吸附法(硅基質),DNA純度高,雜質等抑制物少,是PCR成功的保證。檢測結果顯示,所抽取的市售12批樣本中均檢出牛源性成分,2批既檢出牛源性成分又檢出馬成分,說明樣本可能存在馬肉摻假為牛肉的問題。

    參考文獻:

    [1] 陸俊賢,唐修君.利用熒光定量PCR技術鑒別畜禽肉中豬源性成分[J].食品研究與開發,2017,38(10):110-112.

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    [3] 苗麗,李志娟等.肉制品中牛源性成分熒光定量聚合酶鏈式反應方法的建立與應用、[J].肉類研究,2015,29(9):30-33.

    [4] 曹際娟,盧行安等.實時熒光PCR技術檢測肉骨粉中牛羊源性成分的方法[J].生物技術通訊,2002,13(2):158-160.

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    [6] 高丹丹,陳燕等.動物制品基因組DNA的提取和純化[J].食品科技,2007,1(8):30-33.

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    [8] 何海寧,洪霞等.實時熒光PCR技術檢測肉骨粉中牛羊源性成分的方法[J].食品與機械,2015,31(6):79-83.

    [9] 劉輝,楊利萍,張濱.PCR及其改進技術在食品檢測中的應用[J].食品與機械,2008,24(4):166-169. [11] 國家企業信用信息公示系統http://www.gsxt.gov.cn/index.html.

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