• 《食品安全導刊》刊號:CN11-5478/R 國際:ISSN1674-0270

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    食品中微生物污染分析及其檢測技術

    2019-07-02 16:22:39 來源: 食品安全導刊

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    □孟云 3M中國有限公司

    □張燕 北京家樂福商業有限公司

    由于國內食品安全問題種類繁多,本文挑選目前關注度較高且風險較高的微生物污染進行分析,并將微生物污染分為3類,即細菌污染、真菌污染和病毒污染。筆者剖析以上3種微生物污染的危害及對食品行業和消費者的影響,介紹主流食源性致病菌微生物檢測技術,包括傳統的培養技術及現代檢測技術等多種檢測方法,并分析各自的優缺點,如傳統的培養基方法、測試片方法、顯微鏡檢測法、分子生物學方法、酶聯免疫法及ATP生物熒光法等經典方法,以期為廣大食品檢測者提供選擇參考性依據。

    食品安全是全球廣泛關注的問題,近年來我國也屢屢發生因食品污染引發的食物中毒事件,而2008年的三鹿奶粉事件更加促使人們對食品安全的進一步關注。有統計顯示,在影響中國食品安全的諸多因素中,微生物污染高居首位。根據中國衛生部通報,在我國1990~1999年間發生的食物中毒事件中,微生物食物中毒居各類食物中毒病原的首位,是威脅中國食品安全的頭號殺手。2007年報告的食物中毒事件中,微生物食物中毒的人數占總數的58.86%。

    1 食品中微生物污染的特點及其危害性

    食品的微生物污染通常由一些致病微生物引起,主要包括細菌、真菌和病毒3類。由于微生物具有較強的生態適應性,食品原料在種植、收獲、飼養、捕撈、加工、包裝、運輸、銷售、保存及食用等眾多環節都可能被微生物污染。同時,微生物具有易變異性,未來可能不斷有新的病原微生物威脅食品安全和人類健康。相較于其他化學污染來說,食品易受微生物污染的特點是與生俱來的,由于微生物在空氣、水、人體等環境中無所不在,這使其成為食品加工過程中無法杜絕污染的因素之一??梢哉f,現代食品安全管理中,微生物污染是頭等大事,食品生產者必須足夠重視,才有可能將其危害控制在安全水平之下。

    1.1 細菌性污染

    細菌性污染是涉及面最廣、影響最大、問題最多的一類食品污染,其引起的食物中毒在所有食物中毒中具有普遍性并極具爆發性。細菌性食物中毒全年皆可發生,具有易發性和普遍性等特點,對人類健康有較大的威脅。

    引起食品污染的微生物主要有沙門氏菌、副溶血性弧菌(Bibrio parahemolyticus)、志賀菌(Shigella)、葡萄球菌等。近年來,變形菌屬、李斯特菌(Listeria)、大腸菌科、弧菌屬(Vibrio)引起的食品污染呈上升趨勢:美國1999年沙門氏菌發病1400萬例,住院16430人,死亡582人,損失達23億美元,其中96%的患者由于攝入受污染食物而被感染;1992年印度爆發霍亂弧菌(Vibrio comma)O139中毒事件,波及孟加拉、巴基斯坦等許多國家;1996年5~8月,日本爆發大腸桿菌O157中毒事件,中毒人數過萬,死亡11人;1999年在美國、2000年在法國也發生過李斯特菌中毒事件……根據美國食品和藥物管理局(FDA)統計,2000~2005年,美國共有470人因飲用生牛奶而感染埃希氏大腸桿菌,總共發生中毒事件18起,涉及16個州。我國食品的細菌性污染現象也非常普遍,其主要是由蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、副溶血性弧菌和沙門氏菌等微生物引起的食物中毒事件。

    1.2 真菌性污染

    真菌在發酵食品行業的應用非常廣泛,但許多真菌也會產生真菌毒素,從而引起食品污染。尤其是20世紀60年代發現具有強致癌性的黃曲霉素以來,真菌與真菌毒素對食品的污染日益引起各方重視。真菌毒素不僅具有較強的急性毒性和慢性毒性,還具有致癌、致畸、致突變性,如黃曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)產生的黃曲霉素,麥角菌(Claviceps purpurea)產生的麥角堿,以及雜色曲霉(Aspergillus versicolor)、構巢曲霉(Aspergillusnidulans)產生的雜色曲霉素等。真菌毒素的毒性可以分為神經毒、肝臟毒、腎臟毒、細胞毒等,如黃曲霉素具有強烈的肝臟毒,可以引起肝癌。

    常見的產毒真菌主要有曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、鐮刀菌(Fusarium)、交鏈孢霉(Alternaria)等。由于真菌生長繁殖及產生毒素需要一定的溫度與濕度,因此真菌性食物中毒往往有較為明顯的季節性和地區性。在我國北方地區食品中黃曲霉素B1污染較輕,而長江沿岸和長江以南地區則較重。有調查發現,肝癌等癌癥的發病率與當地的糧食霉變現象有一定關系。

    1.3 病毒性污染

    與細菌、真菌不同,病毒的繁殖離不開宿主,所以病毒往往先污染動物性食品,然后通過宿主、食物等媒介進一步傳播。帶有病毒的水產品、患病動物的乳/肉制品一般是病毒性食物中毒的起源。同細菌、真菌引起的病變相比,食源性病毒引發的疾病更加難以得到有效治療,且更容易爆發流行。

    常見食源性病毒主要有甲型肝炎病毒(HepatitisA)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E)、輪狀病毒(Rotavirus)、諾瓦克病毒(Norwalk)、朊病毒(Prion)、禽流感病毒(Avian influenza)等,這些病毒曾經或仍在肆虐,造成了許多重大的疾病群發事件。1988年初,上海市區居民因食用被甲型肝炎病毒污染的毛蚶(Scapharca subcrenata)而導致甲型肝炎爆發流行,發病人數達30萬;由朊病毒引起的瘋牛病于1986年首先在英國被確認,迄今為止,全球共有100余人死于這一病癥,據估計,西歐已有50萬人被瘋牛病病毒所感染;自H5N1型高致病性禽流感病毒引起的禽流感疫情爆發以來,全球各地不乏有死亡病例報道;美國目前每年約有2300萬例諾瓦克(諾如)病毒性胃腸炎。

    2 食品中微生物的檢測技術及其趨勢

    2.1 傳統檢測方法

    2.1.1 瓊脂平板培養法

    因培養基不同,瓊脂平板法分為選擇性培養基檢測法和顯色培養基檢測法。選擇性培養基是在培養基中加入選擇性抑制劑來抑制非目標微生物生長;顯色培養基是在培養基中加入細菌特異性酶的顯色底物,以菌落顏色區分目的菌落與非目的菌落。

    2.1.2 顯微鏡鏡檢法

    將待測樣品中的微生物富集后,于油鏡下直接計數。顯微鏡鏡檢法通常與瓊脂平板培養法結合使用,通過瓊脂平板培養法對菌落進行定性分析,再用顯微鏡進行定量計數。傳統檢測方法雖然對設備要求不高,技術含量也偏低,但耗時長,人工消耗量大,一般檢測實驗室可根據實際情況合理挑選檢測方法,無需拘泥于方法選擇的形式。

    2.1.3 微生物測試片檢測技術

    一般情況下,微生物測試片由印有網格的聚丙烯薄膜和覆蓋有培養基和顯色物質的聚乙烯薄膜組成。待測樣品經過處理后可直接接種在微生物測試片上,然后放置在適宜的溫度下培養——使固定在測試片上的顯色物質與待檢微生物生長產生的特異性酶發生顯色反應,形成有顏色的菌落,通過對這些菌落進行計數便可實現檢測。測試片法菌落典型,易于判讀,且因其操作簡便、計數直觀,多數可縮短培養周期從而快速得到結果,而且人為操作環節較少,商品化程度高,避免了因人為因素造成誤差較大的缺點。

    測試片法是最為成熟的食源性微生物快速檢測方法之一。對于一些熱敏感的細菌,由于測試片在整個操作過程中均處于常溫環境,可有效避免熱損傷,因此能夠提供更加精準的計數結果。目前,市場上較為成熟的系列微生物測試片主要生產廠家包括美國3M公司、德國默克公司、北京陸橋公司、北京良潤生物科技有限公司等,該測試片可分別檢測菌落總數、大腸菌群及大腸桿菌計數、霉菌和酵母計數、腸桿菌科計數、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等,且微生物測試片與傳統檢測方法之間的相關性非常好,均可達統計學上無顯著性差異。目前,因其快速簡便的特性,故已廣泛應用于我國食品行業和環境、過程及成品的檢測。但是,由于我國國標的現狀——檢測方法為強制性標準,所以目前該方法僅用于工廠內控。在此,基于行業需求特點,筆者也呼吁將來國家標準可以進行改進,增加更多簡便等效性方法,以方便更多的檢測行業可以根據自身特點靈活應用微生物檢測方法。

    2.2 現代檢測方法

    2.2.1 分子生物學檢測方法

    目前,市場上對突發感染性或傳染性疫情溯源及預警的需求越來越多,傳統的分型技術因分辨能力有限,已無法滿足以上需求,因此促進了基因分型技術的產生——從分子生物水平上研究生物大分子,包括核酸結構及其組成成分?,F在已經發展起來的基因分型技術大致分為兩類,即非PCR技術和PCR的技術。最初的非PCR基因分型技術是酶切和雜交方法,需要預知基因組信息,費用巨大,對操作人員的技術要求也相對較高。PCR技術的發明為食源性病原微生物的檢測提供了非常有力的手段,如環介導等溫核算擴增。該方法近年來被食品工業用戶較多地用于致病菌快速檢測,其操作簡便、增菌時間短、擴增時效快且結果準確,但不足之處在于工業用戶對實驗室布局把控尚需改進,避免交叉污染帶來的假陽性上作改進?;蚍中图夹g不但為細菌傳播動力學提供許多重要的結論,而且為進一步研究細菌種系發生特征提供了新的途徑。

    2.2.2 ATP生物發光法

    ATP生物發光法的基本原理是基于死/活菌的ATP含量差別?;畹木w中ATP含量恒定,而菌體死亡后,由于細胞內酶的作用,菌體中的ATP將迅速被分解,因此可以通過測定待測菌體中ATP的濃度從而計算出活菌數。與傳統微生物檢測方法相比,ATP生物發光法檢測食源性微生物時更簡便靈敏、快速高效,并且相關儀器的開發應用也能同時發展起來,例如液閃計數器、照度計等小型化的測試儀器非常便于攜帶,適合在現場對食品衛生進行檢測,可以說是目前檢測微生物數目最快捷的方法之一,因此被廣泛應用于微生物檢驗和食品生產環境清潔度的檢測。ATP生物發光法的缺點在于其易受到鹽分及其他化學物質、游離態等非目標的干擾,若忽略這些干擾因素,必然會使檢測結果受到影響,而且此方法不能區分微生物與非微生物ATP。近年來,基于ATP技術原理,許多儀器生產廠家提供了大量解決方案用于商業無菌檢測,經較短于傳統方法報文后,將食品基質內的ATP進行講解,釋放微生物胞內ATP,并用儀器進行檢測后,從而達到商業無菌快速檢測,為廣大乳品、飲料企業所歡迎的商業無菌快速檢測方法。

    2.2.3 酶聯免疫技術

    最初的免疫酶測定是使酶與抗體或抗原結合以檢查組織中相應的抗原或抗體的存在。經過優化發展,其逐步演變成目前應用較廣的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)——首先用固相載體將抗原或抗體吸附,然后在載體上對免疫酶進行染色,一段時間后用肉眼或分光光度計進行結果判定分析。酶是一種極為敏感的有機催化劑,少量的酶便可催化大量的反應,其在與抗體或抗原結合的情況下仍可保持酶本身的生物活性,且不改變抗體或抗原的特性,反應后的有色產物可用肉眼定性觀察及用酶標儀等光學儀器進行精準定量檢測。

    3. 結語

    綜上所述,由于食品中微生物污染的不可避免性,食品從業者應該重視食品微生物污染,并掌握精準的檢測方法選擇最適合自身需求的方法,從而快速準確的找到目標微生物,完成檢測的目的,準確掌握食品微生物污染的情況。因此,進一步分析污染源頭,并找出最佳的合理的預防措施,方能實現食品中微生物污染監控的目的,為食品安全保駕護航。

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