• 《食品安全導刊》刊號:CN11-5478/R 國際:ISSN1674-0270

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    HPLC法測定面包中 丙酸鈣含量的不確定度評定

    2018-05-14 15:30:19 來源: 食品安全導刊

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                         □ 董偉博 楊海軍 山東斯派克森檢測技術服務有限公司
     
        測量不確定度是與測量結果相聯系的參數,本文通過采用HPLC法測定了面包中丙酸鈣的含量,并對其相對擴展不確定度進行了評定。
        丙酸鈣作為防腐劑可以添加在焙烤類食品中,限量為2.5g/kg(以丙酸計)。高效液相色譜法(HPLC)是測定食品中丙酸鈣的國家標準方法。測量不確定度是與測量結果相聯系的參數,用于表征賦予被測量之值的分散性。當測量結果處于臨界值時食品檢驗機構必須進行測量不確定度評定。本文對HPLC法測定面包中丙酸鈣含量的不確定度因素進行了評定,計算出不確定度并報告了結果。
     
    1 儀器、試劑、色譜分析條件
    1.1 儀器
        高效液相色譜儀,島津LC-20AT,附紫外檢測器和自動進樣器;高速冷凍離心機,北京雷勃爾LR10-2.4A;超聲波清洗器,昆山市超聲儀器KQ-100;高速組織搗碎機,上海精科DS-1;pH計,上海儀電科學PHS-3C;電子天平,上海上天FA2004;溶劑過濾器及0.45μm微孔濾膜。
     
    1.2 試劑
        分析純磷酸(H3PO4)、分析純磷酸氫二銨[(NH4)2HPO4]、實驗室用超純水、食品添加劑丙酸鈣純度標準物質(GBW(E)100078)。
     
    1.3 色譜分析條件
        色譜柱:Agilent ZORBAX SB-Aq 4.6×250mm,5μm,P.N.880975-914;流動相:1.5g/L;磷酸氫二銨溶液,用1mol/L磷酸溶液調pH為3.0(使用時配制);經0.45μm微孔濾膜過濾;流速:1.0mL/min;柱溫:25℃;進樣量:10μL;紫外檢測器波長:214nm。
    2 樣品處理與標準溶液曲線的繪制
        依據國家標準GB 5009.120-2016進行試驗。
     
    2.1 樣品制備
        將面包樣品經組織搗碎機搗碎混勻,準確稱取以上樣品5g(精確至0.0001g)至100mL燒杯中,加水20mL,加入1mol/L磷酸溶液0.5mL,混勻;經超聲浸提10min后,用1mol/L磷酸溶液調pH為3左右,轉移試樣至50mL容量瓶中,用水定容至刻度,搖勻。將試樣全部轉移至50mL具塞塑料離心管中,以不低于4000r/min的速度離心10min,取上清液,經0.45μm微孔濾膜過濾后,待液相色譜測定。
     
    2.2 標準曲線的繪制
        準確吸取5.0mL丙酸標準貯備液(10mg/mL)于50mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,配制成濃度為1.0mg/mL標準工作液。再準確吸取標準工作液0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL至10mL容量瓶中,分別加入1mol/L磷酸0.2mL,用水定容至10mL,混勻。其丙酸標準溶液的最終濃度分別為0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL,經0.45μm微孔濾膜過濾,濃度由低到高進樣分析,以濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標,繪制標準曲線。
    3 測量數學模型
    樣品中丙酸鈣含量(以丙酸計),按式(1)計算:
     
        式中:
        X為樣品中丙酸鈣的含量(以丙酸計),單位為克每千克(g/kg);c是由標準曲線得出的樣液中丙酸的濃度,單位為毫克每毫升(mg/mL);V是樣液最后定容體積,單位為毫升(mL);m為樣品質量,單位為克(g);f是稀釋倍數。
        注:試樣中測得的丙酸含量乘以換算系數1.2569,即得丙酸鈣含量。計算結果保留3位有效數字。
    4 根據數學模型分析影響不確定度的因素
        不確定因素有以下幾方面:①樣品稱量引起的不確定度;②樣品平行測定引起的不確定度;③樣品定容引入的不確定度;④標準系列溶液配置引起的不確定度;⑤標準曲線擬合引入的不確定度。
    5 不確定度評定
    5.1 樣品稱量引起的不確定度(B類不確定度)
        本試驗所用電子天平為萬分之一,最小分度值為0.1mg,由校正證書查得天平重復性標準差0.3mg,天平重復性標準差應計算為2次。則稱樣量為5.0026g,相對不確定度為:Urel(m1)=u(m1)/m=0.00043/5.0026=8.6× 10-5;
     
    5.2 樣品平行測定引起的不確定度(A類不確定度)
        試驗中對同一樣品丙酸鈣的含量進行了3次平行測定其結果分別為:1.08g/kg、1.07g/kg、1.10g/kg,平均值 =1.08g/kg,標準偏差==0.0158g/kg,
        按均勻分布計算,其不確定度為UA=0.0158/ =0.0091g/kg,則相對不確定度為Urel(A)=UA/ =0.0091/1.08=8.4×10-3;
     
    5.3 樣品定容體積引入的不確定度(B類不確定度)
        20℃時50mL A級容量瓶的允許誤差為±0.05mL,按均勻分布計算,由此帶來的不確定度為u=0.05/ =0.0289mL;50mL A級容量瓶重復充液2次,用極差計算,其極差為R=0.015mL,由極差系數C及自由度υ,則充液帶來的不確定度為0.015/1.13=1.3 ×10-2mL;試驗溫度為20±2℃,水的體積在20℃膨脹系數為2.1× 10-4,溫差變化引起體積的變化為:50 ×2 ×2.1× 10-4=0.021mL,按均勻分布計算,溫度變化引起的不確定度為:0.021/ =0.0121mL。
    則樣品定容引入的相對不確定度Urel(v1)= /50=6.8 ×10-4。
     
    5.4 標準系列溶液配制引入的不確定度(B類不確定度)
    5.4.1 標準儲備液引入的不確定度
        ①丙酸鈣標準品的純度,證書上給出的純度99.7%,不確定度為0.6%,則標準物質引入的不確定度0.006/ =0.0035。
        ②本試驗所用電子天平為萬分之一,最小分度值為0.1mg,由校正證書查得天平重復性標準差0.3mg,天平重復性標準差應計算為2次。則u(m2)==0.00043(g),稱標準品為0.3146g,則由稱量引入的相對不確定度為:0.00043/0.3146=0.0014。
        ③標準物質稀釋引入的不確定度
        a.20℃時25mL A級容量瓶的允許誤差為±0.03mL,按均勻分布計算,由此帶來的不確定度為0.03/ =0.0173mL。
        b.25mL A級容量瓶重復充液2次,用極差計算,其極差為R=0.015mL,由極差系數C及自由度υ,則充液帶來的不確定度為0.015/1.13=1.3 ×10-2mL。
        試驗溫度為20±2℃,水的體積在20℃膨脹系數為2.1 ×10-4,溫差變化引起體積的變化為:25× 2 ×2.1× 10-4=0.0105mL,按均勻分布計算,溫度變化引起的不確定度為:0.0105/ =0.0061mL。則標準儲備液由稀釋引入的相對不確定度:Urel(v2)= /25=0.0009,由此,丙酸鈣標準儲備液引入的不確定度為:Urel(標儲)= =0.0039。
    5.4.2 標準系列溶液由稀釋引入的不確定度
        ①由5mL A級單標移液管引起的相對不確定度來自三個分量
        a.5mL A 級單標移液管引的容量誤差查證書為±0.015mL,按均勻分布,不確定度為0.015/ =8.7× 10-3(mL)。
        b.5mL A級單標移液管的充液重復性引起的不確定度,重復充液兩次,用極差計算,其極差為R=0.015mL,由極差系數C及自由度υ,則由充液引入的不確定度為0.015/1.13=0.013(mL)。
        c.試驗溫度變化為±2℃,水的體積在20℃膨脹系數為2.1×10-4,按均勻分布,由溫度變化引入的不確定度為2.1×10-4×5× 2/=0.0012(mL),則5mL A級單標移液管體積引入的不確定度為 =0.016(mL),由此,5mL A級單標移液管體積引入的相對不確定度為0.016/5.00=0.0032。
        ②標液定容體積引入的不確定度
        a. 50mL A級容量瓶體積引入的相對不確定度。
        a1.20℃時50mL A級容量瓶的允許誤差為±0.05mL,按均勻分布計算,由此帶來的不確定度為0.05/=0.0289mL。
        b1.50mL A級容量瓶重復充液2次,用極差計算,其極差為R=0.015mL,則充液帶來的不確定度為0.015/1.13=1.3×10-2mL。
        c1.試驗溫度為20±2℃,水的體積在20℃膨脹系數為2.1×10-4,溫差變化引起體積的變化為:50×2×2.1×10-4=0.021mL,按均勻分布計算,溫度變化引起的不確定度為:0.021/ =0.0121mL。
        由此,50mLA級容量瓶體積引入的相對不確定度為Urel(v2)= /50=6.8 ×10-4
        b.10mL A級容量瓶體積引入的相對不確定度
        a1.20℃時10mL A級容量瓶的允許誤差為±0.02mL,按均勻分布計算,由此帶來的不確定度為0.02/ =0.0115mL。
        b1.10mL A級容量瓶重復充液2次,用極差計算,其極差為R=0.015mL,由極差系數C及自由度υ,則充液帶來的不確定度為0.015/1.13=1.3×10-2mL。
        c1.試驗溫度為20±2℃,水的體積在20℃膨脹系數為2.1×10-4,溫差變化引起體積的變化為:10×2×2.1 ×10-4=0.0042mL,按均勻分布計算,溫度變化引起的不確定度為:0.0042/ =0.0024mL。
        由此,10mL A級容量瓶體積引入的相對不確定度為:Urel(v4)= /10=1.75×10-2
        至此,標準系列溶液由稀釋引入的不確定度:Urel(v5)= =0.018
     
    5.5 標準曲線擬合引起的不確定度
        采用7個濃度水平丙酸鈣標準溶液,得出峰面積,用最小二乘法擬合,得到標準曲線
    Y=175471x+2485.6,本試驗對同一樣品進行了3次測量,求得平均值 =1.08g/kg,因此由標準曲線擬合帶來的標準不確定度為:
     
        式中:SR回歸曲線的剩余標準差,b為斜率,p為待測樣品的重復測定次數(p=3),n為回歸曲線的點數n=7,c待測樣品濃度的平均值,c0為回歸曲線各點濃度的平均值,c0i為各標準溶液濃度值。
         


        由上述表中數據計算出SR回歸曲線的剩余標準差,即:
     
     

        擴展不確定度:取p=95%,kp=2,則U=uc k=0.025×2=0.05g/kg
        報告結果:1.08±0.05g/kg(k=2)
        不確定度表達測量結果的分散程度,是一個定量的概念,可以用定量的數字描述。本文對HPLC法測定面包中丙酸鈣含量的不確定度因素進行了評定,若檢測結果處于標準限量的臨界值或標準方法有要求時,必須結合不確定對檢測結果進行評判。
     
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