• 《食品安全導刊》刊號:CN11-5478/R 國際:ISSN1674-0270

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    水產品快檢技術在獸藥殘留方面的研究進展

    2017-11-20 16:42:03 來源:

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    □ 李云 石家莊市畜產品質量監測中心
    □ 陳笑笑 王偉萍 杭州南開日新生物技術有限公司
        水產品是人們生活中的重要食物來源,它的安全問題備受關注,其獸藥殘留問題更是敏感,目前已有多種快檢技術應用于水產品獸藥殘留領域的檢測。本文主要概述了化學比色法、酶聯免疫法、膠體金免疫層析法和量子點熒光免疫分析法等多種快檢技術在水產品獸藥殘留檢測方面的研究進展。
        我國是世界上水產品產量最大的國家之一,作為餐桌上的佳肴,伴隨水產品需求量的不斷增長,安全問題也日趨嚴峻。水產品的安全風險主要來源于水體中的消毒劑、重金屬及飼料中的農藥和獸藥殘留,其中,獸藥殘留問題較為突出。為避免水產品安全事故的發生,有效的獸藥殘留檢測技術必不可少。
    快速檢測技術
        目前,常規的檢測方法多為儀器分析法,其靈敏度和準確度都比較高,但存在費用高、檢測周期長等問題,無法滿足現場快速檢測的需求,因此,簡單快速的檢測技術具有廣闊的應用前景。本文對化學比色法、酶聯免疫法、膠體金免疫層析法和量子點熒光免疫分析法等多種快檢技術在水產品獸藥殘留檢測方面的研究進展作一綜述。
    放射免疫測定法
        1959年,Yelow等建立了放射免疫測定法(RIA),其基本原理是標記抗原和非標記抗原對專一抗體的競爭抑制作用,利用了放射性示蹤的靈敏度和抗原-抗體反應的特異性。李佐卿等利用放射免疫法來檢測魚肉和雞肉中磺胺類藥物的殘留量,其中對魚肉樣品加標10μg/kg進行了18次測定,精密度為5.4%,測定低限能達到10μg/kg。陳鍵等研究了放射免疫法檢測鰻魚中磺胺類藥物殘留,驗證了磺胺類藥物在最大殘留限量50μg/kg時的檢測穩定性,并且90min即可得到檢測結果。陳小雪等采用放射免疫法對水產品中氯霉素殘留進行了分析,檢測低限為0.15μg/kg。鄭晶等利用放射免疫法快速篩檢烤鰻中四環素類藥物殘留,檢測限為50μg/kg。目前,放射免疫測定法以其高靈敏度已被廣泛應用于多個領域。
    酶聯免疫吸附法
        1971年,瑞典學者Engvail和Perlman與荷蘭學者Van Weerman和Schuurs幾乎同時建立了檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法,即酶聯免疫法(ELISA),其基本原理是酶與抗體或抗抗體共價結合,形成酶標記復合物,再與相應的抗原形成酶標記的抗原抗體復合物,然后相應的底物在酶的催化下反應生成另一種有色產物。
        周大勇建立了諾氟沙星的競爭性酶聯免疫吸附測定法,其檢測范圍為10~500ng/mL,最小檢測濃度為4.6ng/mL。同時,周大勇測定了9種諾氟沙星類似物和一些抗菌素的交叉反應率,其中洛美沙星的交叉反應率最高,達到了64.18%,其余8種類似物的交叉反應率均小于10%。采用這種方法測定草魚魚肉中的諾氟沙星含量,回收率為82.06%。李雅麗建立了基于多克隆抗體的間接ELISA方法來檢測喹諾酮,該法可用于豬肉和魚肉組織中19種喹諾酮類藥物的檢測,效果良好。
        Umaporn等利用ELISA法測定蝦中5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)的殘留,檢出限為0.16μg/kg。Jester Edward等使用R-Biopharm公司生產的ELISA試劑盒檢測了魚肉樣品中的硝基呋喃藥物殘留,與使用LC-MS-MS檢測的結果吻合度較高。李亞楠等建立了測定呋喃妥因代謝物的直接競爭酶聯免疫法,線性檢測范圍為0.177~11.508ng/mL,其中魚肉的最低檢測限為0.109μg/kg。
        鄭晶利用酶聯免疫法來測定鰻魚中恩諾沙星的殘留量,當樣品濃度為0.3~ 10μg/kg時,最低檢測限為3μg/kg;當樣品濃度增加至25~100μg/kg時,回收率為66.5%~76.6%,靈敏度為0.3μg/kg。劉曉紅等利用酶聯免疫法測定鯉魚中恩諾/環丙沙星的殘留量,當濃度為10~810mg/kg時,最低檢測限為10μg/kg;當樣品添加濃度為20~500μg/kg時,回收率為76.6%~80.9%。李宗妍等建立了一步法酶聯免疫法測定水產品中恩諾沙星的殘留,檢測限為10μg/kg,在10~40μg/kg濃度范圍內,檢測回收率可達70%以上,檢測時間縮短至2h以內。馮婷婷等利用抗恩諾沙星單克隆抗體建立了酶聯免疫吸附法用來檢測動物源性食品中恩諾沙星的殘留,檢測范圍為0.5~50μg/L,最低檢測限為0.2μg/L,在雞肉、魚肉、蝦和蜂蜜樣品中的回收率為93.3%~122.7%。
        酶聯免疫吸附法的特異性強,且簡便快速,在水產品獸藥殘留快速檢測方面應用廣泛,許多公司已具有商品化產品。酶聯免疫吸附法作為目前研究較為成熟的快檢方法,在市場上占有較大份額。
    膠體金免疫層析法
        1971年,Faulk和Taylor首次將膠體金應用于免疫分析。此后,Osikowicz和Beggs等將膠體金免疫層析技術應用于人類絨毛腺激素的定性檢測中,其基本原理是以膠體金(紅色)作為示蹤標記物,讓其與蛋白質等多種大分子物質結合,再利用抗原抗體反應達到檢測目的。
        韓靜等首次建立了同時檢測豬肉、雞肉、鯽魚中磺胺異噁唑、磺胺噻唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺氯噠嗪的多殘留免疫膠體金試紙條檢測方法,視覺檢測限為0.01mg/kg,檢測時間小于10min。馮婷婷等建立了同時檢測11種喹諾酮類藥物的膠體金免疫層析方法,對豬肉和蝦中恩諾沙星、環丙沙星和氧氟沙星的檢測限均為30ng/g,整個檢測過程(包括樣品前處理)可在20 min內完成。吳茂生等利用膠體金免疫層析法對水產品中呋喃妥因代謝物殘留進行檢測,檢測限為1.0μg/kg,假陽性率低于5%,假陰性率為0,且通過液質聯用法確證,兩者結果一致。張敏等研制出一種快速檢測水產品中磺胺類藥物的膠體金免疫試紙條,該試紙條對水產品中的磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶的檢出限分別是5μg/kg、40μg/kg、45μg/kg和100μg/kg,與四環素、鹽酸克倫特羅、環丙沙星、氯霉素等無交叉反應,說明檢測試劑的靈敏度和特異性都較高。檀尊社等建立了一種用于快速檢測水產樣品中四環素類藥物殘留量的膠體金免疫層析法,最低檢測限可達100ng/mL,檢測僅需5~10min,且與沙丁醇胺等其他獸藥之間無交叉反應。
        膠體金免疫層析法是目前快檢市場上炙手可熱的檢測手段,其借助檢測試紙作為載體,操作簡便,檢測時間大大縮短,在水產品獸藥殘留方面有極大的應用,而以此為基礎的大量研究也在進行中。
    化學發光免疫分析法
        化學發光免疫分析法是Halman根據放射免疫分析的基本原理將具有高靈敏度的化學發光測定技術與高特異性的免疫反應相結合的一種方法。其操作流程是將發光物質或酶標記在抗原或抗體上,免疫反應結束后,加入氧化劑或酶底物而發光,通過測量發光強度,根據標準曲線測定待測物的濃度。
        高彬文等建立了一種檢測魚和蝦肌肉中氯霉素殘留的化學發光酶聯免疫法,檢測限為5.8×10-4μg/kg,與傳統的酶聯免疫法相比其更加靈敏。劉鄧等研制出一種基于魯米諾-辣根過氧化物酶體系的化學發光免疫分析試劑盒,用于檢測食品中痕量恩諾沙星殘留,檢測線性范圍為0.024~2.76ng/mL,其中對魚肉和蝦肉樣本的添加回收率分別在92%~112%和86%~112%之間。謝體波等研究了化學發光檢測試劑盒對畜禽及水產品中呋喃唑酮代謝物殘留的檢測效果,發現試劑盒對豬肉、雞肉、魚肉、蝦肉4種樣品的最低檢測限分別為0.097μg/kg、0.098μg/kg、0.097μg/kg、0.091μg/kg,靈敏度很高,且檢測只需要10min。
        化學發光免疫分析法的推廣應用速度非???,在快速檢測方面擁有巨大的潛力,同時化學發光檢測技術與其他技術聯用的研究也在不斷進行,有望催生出更好的食品安全檢測方法。
    量子點熒光免疫分析法
        1998年,Chan等發現在牛血清白蛋白中,多克隆抗體能夠識別量子點標記的免疫球蛋白,使量子點聚集在一起。由此,量子點開始應用于熒光免疫分析中,其基本原理就是將量子點作為示蹤標記物應用于免疫層析法中。
    Sai等建立了基于小分子半抗原直接包被方式和量子點熒光探針結合的新型熒光免疫分析方法,并將其用于檢測蝦仁中的氯霉素。該法的靈敏度為30.2ng/mL,最低檢出限為1.2ng/mL,與傳統的酶聯免疫法相比,靈敏度提高約5倍,檢測時間縮短了1h。田瑋研究了用于檢測魚中氯霉素殘留的量子點熒光免疫分析法,其靈敏度高且檢測時間短。居瑩制備出具有免疫活性的量子點熒光探針,并組裝成孔雀石綠量子點免疫試紙條,其檢測限為1.5μg/kg。張蕾應用CdTe量子點研制出呋喃唑酮快速熒光免疫層析試紙條,檢測了水產品蝦肌肉組織中呋喃唑酮代謝物的殘留量,檢測限為10.0ng/g,假陰性率和假陽性率均小于5%,且與呋喃西林代謝物、呋喃它酮代謝物和呋喃妥因代謝物的交叉反應率均小于1%。
        量子點熒光免疫分析法是量子點在食品領域的應用,彌補了傳統快檢方法靈敏度不高、抗干擾能力不強的缺點,促進了食品安全快速檢測技術的發展。
    化學比色法
        化學比色法主要包括試紙、試劑盒等,相對于其他快速檢測方法,是一種操作簡單的檢測手段,適用于大批量樣品的檢測。
        竇紅建立了一種用于快速檢測水產品中孔雀石綠及其代謝物的化學比色法,孔雀石綠及其代謝物的檢出限分別為2μg/kg和4μg/kg。錢蓓蕾等研究出了一種用于檢測孔雀石綠殘留的快速檢測試劑盒,檢測限為1.0~10.0μg/kg。
        由于化學比色法的靈敏度較低,在水產品獸藥殘留快速檢測方面的應用前景有限,目前不再著重于該法的研究,而是尋找更好的方法。
    表面增強拉曼光譜
        1974年,Fleischman等發現吸附在粗糙銀電極表面上的吡啶分子可以得到增強的拉曼信號。隨后,Jeanmaire等證實了該光譜現象,表面增強拉曼光譜技術(SERS)由此產生,其基本原理是拉曼散射效應產生的分子振動光譜,該光譜反映了分子的特征結構信息。
        顧振華等研究了使用便攜式拉曼光譜儀對水產品水樣中孔雀石綠進行快速檢測的方法,檢測限為5.0μg/L,常見物質對其測定無干擾,且從樣品制備到結果顯示一般只需要3min。Zhang等建立了一種魚肉產品中恩諾沙星、呋喃唑酮和孔雀石綠的SERS分析方法,可以檢出羅非魚魚片中1.0μg/g的呋喃唑酮和200ng/g的孔雀石綠。隨后,該研究小組又利用SERS檢測魚肉中的孔雀石綠和結晶紫,檢測最低濃度分別為1.0μg/kg和2.0μg/kg。Fu等也建立了一種水產品中孔雀石綠的SERS分析方法,其線性范圍為2.5~100μmol/L,檢測限為2.5μmol/L。鐘堅海等將表面增強拉曼光譜與分子印跡和磁性納米技術相結合,實現了對養殖水和蝦肉中孔雀石綠的高效富集,檢測限分別為0.5ng/mL和6ng/g。
        除了對孔雀石綠檢測的研究,表面增強拉曼光譜在抗生素檢測方面也有應用。賴克強等對磺胺類抗生素進行了SERS探測,能夠檢測到的最低濃度為10ppb。隨后,研究小組又結合化學計量法快速檢測了水產品中磺胺甲基嘧啶的殘留,結果表明SERS技術對磺胺甲基嘧啶標準溶液的檢出限為5ng/mL,魚肉中磺胺甲基嘧啶的檢出限為20ng/mL。馬海寬等以銀溶膠為表面增強拉曼活性基底,檢測出磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的最低限度均為1ppm,檢測限分別為0.16ppm、0.59ppm,實現了魚肉中磺胺類抗生素的痕量檢測。
        表面增強拉曼光譜無損樣品、可用于現場快速檢測的特點使其具有廣闊的應用前景,但是其選擇性和數據重現性較差極大地限制了該法的推廣,因此,需要進一步與其他技術相結合,進而加大對拉曼增強基底的研究。
        水產品中的獸藥殘留是當前社會關注的熱點問題,也是人們生活中時刻關注的問題。除了從源頭上進行控制,還需要可靠的快速檢測技術作為支撐,保障人們的食用安全。目前,已有多家公司擁有成熟的快檢商品化產品用于現場快速篩查,且進一步的研究也在持續進行。本文簡要介紹了幾種用于水產品獸藥殘留的快檢方法,無論是已經較為成熟的快檢方法,還是仍處于研究中的方法,都將為人們的食品安全提供一層屏障,相信未來還會有更多、更好的快檢技術誕生。
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