• 《食品安全導刊》刊號:CN11-5478/R 國際:ISSN1674-0270

    登陸 | 注冊 | 設為首頁 | 加入收藏

    高效液相色譜串聯質譜法檢測豆芽中的6-芐基腺嘌呤含量

    2016-08-23 17:27:52 來源: 食品安全導刊

    評論0  我來說兩句
           6-芐基腺嘌呤(6-benzylaminopurine,6-BA)是一種人工合成的細胞分裂素,與植物內源性激素具有相似的結構及性質,為一種植物生長調節劑[1]。如果人體攝入過量會刺激皮膚黏膜,出現食道和胃黏膜損傷、惡心、嘔吐等癥狀。目前,測定豆芽中6-BA的方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-大氣壓化學源質譜法及液相色譜—串聯質譜法[2-4]等。本研究采用LC-MS/MS法來測定豆芽中的6-BA,提取試劑為酸化甲醇,以乙腈及水(含0.1%甲酸)為流動相進行梯度洗脫,經過反相色譜分離后以多反應監測方式進行檢測。            
      材料和方法
      儀器 API 4000型三重四極桿串聯質譜儀,LC-20A液相色譜儀(包括二元輸液泵及自動進樣器)。藥品及試劑 6-BA標準品(含量97.0%),甲醇、乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純。
      標準儲備溶液 精密稱取6-BA 0.1000g于100mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,作為標準儲備溶液。此標準儲備溶液每毫升相當于1.0mg 6-BA。
      色譜柱:Symmetry C18柱,3.5m,150×2.1mm I.D.,waters公司;流動相:乙腈-水(含0.1%甲酸);流速:0.25 mL/min;柱溫:25℃;進樣量:10μL。梯度洗脫條件見表1。

     \
      質譜條件 采用電噴霧離子化源;離子噴射電壓:5500V;溫度:500℃;源內氣體1(GS1,N2)壓力:55psi;氣體2(GS2,N2)壓力:55psi;氣簾氣體(N2)壓力:15psi;正離子方式檢測;6-BA的解簇電壓(DP)為70V,碰撞能量(CE)為80eV;用于定量分析的離子反應為m/z 226.2→m/z 64.9,6-BA結構及[M+H]+的產物離子掃描質譜圖見圖1。
    \
      圖1 6-BA的結構及[M+H]+的產物離子掃描質譜圖
      豆芽樣品的預處理 稱取豆芽樣品500g用食物粉碎機粉碎后,取5g樣品(精確至0.01g)于50mL聚丙烯離心管中,加入10mL酸化甲醇(每100mL甲醇中加入乙酸100μL,混勻),用均質機勻質3min,超聲提取3min,1,2000rpm離心10min,上清液轉入25mL容量瓶中,樣品再用10mL酸化甲醇重復提取一次。合并上清液,用水定容至刻度,搖勻,取部分液體經0.45μm濾膜過濾,供LC-MS/MS分析。
      空白豆芽萃取液制備 選擇在生產過程中未添加6-BA的豆芽。按1.6試樣處理方法提取,經0.45μm有機濾膜過濾??蛇M行LC-MS/MS分析,以確定在6-BA出峰處不存在干擾。
      結果與討論
      色譜行為和專屬性 按“豆芽樣品的預處理”操作, 分別制備空白豆芽樣品、空白豆芽加入6-BA標準溶液(相當于含15μg/kg6-BA的豆芽樣品)進行測試。典型色譜圖分別見圖2-A和圖2-B。結果表明:空白豆芽中的內源性物質不干擾6-BA的測定。
    \
     
      圖2 測定豆芽中6-BA的典型MRM色譜圖
      線性范圍和靈敏度 取空白豆芽萃取液,依次加入適量6-BA標準系列溶液,配制成相當于豆芽濃度為2.5、5、15、45和100μg/kg的豆芽樣品萃取液,按“豆芽樣品的預處理”項下操作,記錄色譜圖;以待測物濃度為橫坐標,待測物峰面積為縱坐標,進行回歸運算,求得的直線回歸方程即為標準曲線(y=1.35e+004x+2.58e+003,r =0.9983)。結果表明6-BA在2.5~100μg/kg范圍內線性良好,方法檢出限為1μg/kg(信噪比S/N=3)。
      回收率和精密度 試驗分別制備了相當于含6-BA 5、15和100μg/kg的低、中、高3個濃度豆芽樣品,按1.6項的操作方法進行處理,每濃度六樣本分析,并與標準曲線同時進行,以當時的標準曲線計算樣品的測得濃度,求得本法的精密度與回收率。低、中、高3個濃度的回收率范圍分別為90%~98%、92%~101%和91%~102%,精密度分別為4.5%、5.6%和8.9%,結果均符合相關要求。
      質譜條件優化 將濃度為100ng/mL的6-BA標準溶液吸入注射器中,放置于蠕動泵進樣器上,以20µL/min的速度進樣,對質譜條件進行優化,盡量使待測物響應信號最高化。在實驗過程中比較了6-BA在正、負兩種離子化方式的響應值,發現正離子化效率高于負離子化效率,正離子響應較為穩定,因此選擇了正離子掃描方式。
      經過Q1全掃描,選擇了響應信號最高的m/z 226.2作為6-BA分析的母離子,在MS2掃描方式下,找到一些碎片離子,其中m/z 91.0響應最高,m/z 64.9次之,在多反應監測掃描方式下,m/z 226.2→m/z 91.0離子對響應信號較高,但干擾較大,故選擇m/z 226.2→m/z 64.9用于6-BA的定量分析。在MRM模式下,在蠕動泵持續進樣的情況下,對各項質譜參數進行優化,使得待測物響應值達到最高。
      色譜條件優化 雖然質譜專屬性高,但將樣品中的內源性物質與待測物進行分離還是必要的,以減少對測定的干擾,所以對色譜條件進行了選擇及優化。
      6-BA在小粒徑的C18色譜柱上都有較好的保留,所以選擇了實驗室常用的Symmetry C18柱(3.5μm,150×2.1mm I.D.)。應用反相色譜條件時,LC-MS/MS分析方法應用的有機相主要為乙腈和甲醇,選用乙腈時,6-BA的色譜行為較好。試驗中發現甲酸的加入會抑制6-BA的信號,但考慮到能夠使待測物與內源性物質充分分離,并且能夠改善峰形,所以選擇了0.1%的甲酸作為水相。
      提取條件的選擇 試驗中考察了以下幾種提取試劑,包括甲醇、酸化甲醇和乙酸乙酯,結果發現酸化甲醇的提取效率要高于另外兩種試劑,而超聲提取的使用同樣會提高待測物的提取效率,所以最終選擇了用酸化甲醇作為提取試劑,進行超聲提取。
      本研究采用高效液相色譜-串聯質譜法來檢測豆芽中的6-芐基腺嘌呤含量,方法采用多反應監測進行定量,排除了內源性物質干擾,提高了專屬性。該法靈敏度高、準確可靠,檢出限達到1μg/kg,前處理方法簡單,有較強的實際應用價值。
      沈陽食品檢驗所
      穆姣姣 崔相勇 周長民 王冬妍

    微信關注

    相關熱詞搜索:腺嘌呤 質譜 液相

    [責任編輯:]

    參與評論

    食安中國 Copyright ? www.strettyender.com 2012-2015 版權所有 海淀分局網絡備案編號:1101085079,1101055372京ICP備09075303號-1

    地址:北京市海淀區西四環中路39號萬地名苑1號樓1004室(郵編100039) 聯系電話:010-88825653   010-88825683  010-64972251   010-88825687   業務咨詢:010-88825689

    狠狠久久亚洲欧美专区