• 《食品安全導刊》刊號:CN11-5478/R 國際:ISSN1674-0270

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    表面微生物檢測方法

    2015-08-14 15:36:33 來源: 中國食品科技網

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      空氣、食品接觸面微生物檢驗方法、檢驗標準

      1、 目的:

      檢測生產車間空氣、操作人員手部、與食品有直接接觸面的機械設備的微生物指標,生產區域環境當中病原微生物的監控,達到規定標準,以控制食品成品的質量。

      2、 參照標準:

      中華人民共和國國家標準《一次性使用衛生用品衛生標準》GB15979-1995、《HACCP原理與實施》、中華人民共和國國家標準《公共場所空氣微生物檢驗方法細菌總數測定》GB/T 18204.1-2000、中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準SN 0169-92/SN 0172-92/ SN 0170-92、 出入境檢驗檢疫局二000四年《出入食品微生物檢驗培訓教材》中《出入食品生產廠衛生細菌檢驗方法》、日本東京冷凍食品檢驗方法。

      3、 采樣與檢測方法:

      3.1空氣的采樣與測試方法

      3.1.1樣品采集:

      (1)取樣頻率:

      a)車間轉換不同衛生要求的產品時,在加工前進行采樣,以便了解車間衛生清掃消毒情況。

      b)全廠統一放長假后,車間生產前,進行采樣。

      c)產品檢驗結果超內控標準時,應及時對車間進行采樣,如有檢驗不合格點,整改后再進行采樣檢驗。

      d)實驗性新產品,按客戶規定頻率采樣檢驗。

      e)正常生產狀態的采樣,每周一次。

      (2)采樣方法

      在動態下進行,室內面積不超過30 m2,在對角線上設里、中、外三點,里、外點位置距墻1 m;室內面積超過30 m2,設東、西、南、北、中五點,周圍4點距墻1 m。采樣時,將含平板計數瓊脂培養基的平板(直徑9 cm)置采樣點(約桌面高度),并避開空調、門窗等空氣流通處,打開平皿蓋,使平板在空氣中暴露5 min。采樣后必須盡快對樣品進行相應指標的檢測,送檢時間不得超過6h,若樣品保存于0~4℃條件時,送檢時間不得超過24h。

      3.1.2菌落培養:

      (1)在采樣前將準備好的平板計數瓊脂培養基平板置37℃±1℃培養24 h,取出檢查有無污染,將污染培養基剔除。

      (2)將已采集樣品的培養基在6 h內送實驗室,細菌總數于37℃±1℃培養48h觀察結果,計數平板上細菌菌落數。

      (3)菌落計算:

      a)記錄平均菌落數,用“個/皿”來報告結果。用肉眼直接計數,標記或在菌落計數器上點計,然后用5~10倍放大鏡檢查,不可遺漏。

      b)若培養皿上有2個或2個以上的菌落重疊,可分辨時仍以2個或2個以上菌落計數。

      3.2工作臺(機械器具)表面與工人手表面采樣與測試方法:

      3.2.1樣品采集:

      (1)取樣頻率:

      a)車間轉換不同衛生要求的產品時,在加工前進行擦拭檢驗,以便了解車間衛生清掃消毒情況。

      b)全廠統一放長假后,車間生產前,進行全面擦拭檢驗。

      c)產品檢驗結果超內控標準時,應及時對車間可疑處進行擦拭,如有檢驗不合格點,整改后再進行擦拭檢驗。

      d)實驗新產品,按客戶規定擦拭頻率擦拭檢驗。

      e)對工作表面消毒產生懷疑時,進行擦拭檢驗。

      f)正常生產狀態的擦拭,每周一次。

      (2) 采樣方法:

      a)工作臺(機械器具):用浸有滅菌生理鹽水的棉簽在被檢物體表面(取與食品直接接觸或有一定影響的表面)取25cm2的面積,在其內涂抹10次,然后剪去手接觸部分棉棒,將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內送檢。

      b)工人手:被檢人五指并攏,用浸濕生理鹽水的棉簽在右手指曲面,從指尖到指端來回涂擦10次,然后剪去手接觸部分棉棒,將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內送檢。

      (3)采樣注意事項:

      擦拭時棉簽要隨時轉動,保證擦拭的準確性。對每個擦拭點應詳細記錄所在分場的具體位置、擦拭時間及所擦拭環節的消毒時間

      3.2.2細菌·大腸菌群的檢測培養:

      樣液稀釋:將放有棉棒的試管充分振搖。此液為1:10稀釋液。如污染嚴重,可十倍遞增稀釋,吸取1ml 1:10樣液加9ml無菌生理鹽水中,混勻,此液為1:100稀釋液。

      3.2.2.1細菌總數:

      (1)以無菌操作,選擇1~2個稀釋度各取1ml樣液分別注入到無菌平皿內,每個稀釋度做兩個平皿(平行樣),將已融化冷至45℃左右的平板計數瓊脂培養基傾入平皿,每皿約15ml,充分混合。

      (2)待瓊脂凝固后,將平皿翻轉,置36℃±1℃培養48 h后計數。

      (3)結果報告:報告每25cm2食品接觸面中或每只手的菌落數

      3.2.2.2大腸菌群:

      (1)平板法:

      a)以無菌操作,選擇1~2個稀釋度各取1ml樣液分別注入到無菌平皿內,每個稀釋度做兩個平皿(平行樣),將已融化冷至45℃左右的去氧膽酸鹽瓊脂培養基傾入平皿,每皿約15ml,充分混合。待瓊脂凝固后,再覆蓋一層培養基,約3-5 ml。

      b)待瓊脂凝固后,將平皿翻轉,置36℃±1℃培養24h后計數。

      c)結果計算: 以平板上出現紫紅色菌落的個數乘以稀釋倍數得出。

      d)結果報告:報告每25cm2食品接觸面中或每只手的菌落數

      (2)試管法:

      a)以無菌操作,選擇3個稀釋度各取1ml樣液分別接種到BGLB肉湯培養基中,每個稀釋度接種三管。

      b)置BGLB肉湯管于36℃±1℃培養48±2h。記錄所有BGLB肉湯管的產氣管數。

      c)結果報告:按BGLB肉湯管產氣管數,查MPN表報告每25cm2食品接觸面中或每只手的大腸菌群值。

      3.2.3金黃色葡萄球菌檢測

      (1)定性檢測

      a) 取1ml稀釋液注入滅菌的平皿內,傾注15-20ml的B-P培養基,(或是吸取0.1稀釋液,用L棒涂布于表面干燥的B-P瓊脂平板),放進36±1℃的恒溫箱內培養48±2小時。

      b)從每個平板上至少挑取1個可疑金黃色葡萄球菌的菌落作血漿凝固酶實驗。

      c) 結果報告:B-P瓊脂平板的可疑菌落作血漿凝固酶實驗為陽性,即報告手(工器具)上有金黃色葡萄球菌存在。

      (2)定量檢測

      a) 以無菌操作,選擇3個稀釋度各取1ml樣液分別接種到含10﹪氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯培養基中,每個稀釋度接種三管。

      b) 置肉湯管于36±1℃的恒溫箱內培養48小時。劃線接種于表面干燥的B-P瓊脂平板,置36℃±1℃培養45~48小時。

      c) 從B-P瓊脂平板上,挑取典型或可疑金黃色葡萄球菌菌落接種肉湯培養基,36℃±1℃培養20~24小時。

      d) 取肉湯培養物做血漿凝固酶試驗,記錄試驗結果。

      e) 報告結果:根據凝固酶試驗結果,查MPN表報告每25 cm2食品接觸面中或每只手的金黃色葡萄球菌值。

      3.3工廠環境中病原體的檢測計劃與方法

      檢測計劃:為了保證食品安全,工廠應該對生產環境中的病原微生物進行檢測和評估,檢測項目包括李斯特菌,沙門氏菌等病原體微生物,化驗室應該按照一定的計劃對生產場所環境中的病原體進行檢測,其中包括地面、下水道、 排水溝、墻壁、天花板、設備框架、運輸的支架,冷藏裝置、速凍機、傳送帶、設備的螺絲、維修工具等部位。當某個點檢測到病員微生物時,應該對環境中的相似點加大檢測頻率;在把所有的預定點檢測完后,應該對環境中的病原微生物的存在狀況進行全面評估,在下一次環境檢測循環過程中加強檢測容易出現病原體的環境點,達到持續改進的目的。

      檢測頻率:每月兩次,每次每個區域至少選取5個檢測點,分別進行檢測。

      3.3.1環境李斯特菌的檢測方法(3MTM PetrifilmTM環境李斯特菌的測試片)

      3.3.1.1用涂抹棒,海綿或者其他采樣設備收集環境樣本。

      3.3.1.2將收集的樣本添加10毫升滅菌的緩沖蛋白胨水,將樣本與緩沖蛋白胨混合1分鐘,將樣品置于室溫(20-30℃)1小時,最久不超過1.5小時,以修復損傷的李斯特菌。

      3.3.1.3將測試片放在平坦處,掀起上層膜。

      3.3.1.4用移液器垂直滴加3毫升樣品到下層膜中央,將上層膜緩慢蓋下,以免產生氣泡。

      3.3.1.5輕輕將塑料壓板放在位于接種區上層膜上,不要壓,扭轉或者滑動壓板。提起壓板等至少十分鐘,以使膠體凝固。

      3.3.1.6將測試片透明面朝上,可疊放至十片,在37℃±1℃培養26-30小時,可以用標準菌落記數器或者其他光學放大器判讀,不要記數圓形輪廓上的菌落,因為他們不受選擇性培養基的影響。

      3.3.1.7對于定性檢測,根據紫紅色菌落是否存在,結果記為檢出或者未檢出。

      3.3.2環境中沙門氏菌的檢測方法

      3.3.2.1采樣地點:選取采樣點時因盡量選取微生物容易滋生的地方

    冷凍車間

    FD車間

    東區初加工

    傳遞窗口表面、排水溝、

    排水溝出口、墻壁、地面

    卸料間

    墻壁、墻角、地面、天花板、

    物料車表面

    東區精加工

    地面、墻壁、墻角、排水溝、

    排水溝出口、速動機鏈條、天花板

    暫存間

    墻壁、地面、天花板、墻角、墻縫

    西區初加工

    傳遞窗口表面、地面、墻壁、

    排水溝、排水溝出口

    挑選間

    墻壁、地面、天花板、墻角、墊板

    西區精加工

    地面、墻壁、墻角、排水溝、排水溝出口、速動機鏈條、天花板

    包裝室

    墻壁、地面、天花板、金探傳送帶表面、落地料存放處

      3.3.2.2操作步驟

      3.3.2.2.1采樣應在生產開始后進行,用已浸潤過的棉拭在選定的被測表面旋轉涂抹約100cm2的面積,然后將棉拭放回涂抹試管并蓋緊。

      3.3.2.2.2將樣品帶回實驗室,每5個點混合成一個樣品,登記編號,按照SN0170-92標準及時檢測,若有陽性結果出現,應逐步對所混合的每個點分別檢測。

      物體表面涂抹菌落總數計算方式:物體表面細菌總數(cfu/c㎡)=平皿上菌落的平均數*采樣液稀釋倍數/采樣面積(cm2)

      根椐GB15979-2002《一次性衛生用品衛生標準》的標準,生產環境衛生指標

      1裝配與包裝車間空氣中細菌菌落總數應≤2 500 cfu/m3。

      2工作臺表面細菌菌落總數應≤20 cfu/cm2。

      3.工人手表面細菌菌落總數應≤300 cfu/只手,并不得檢出致病菌。

      人員和環境衛生檢測方法

      一、 空氣采樣及檢驗方法

      1培養基:普通營養瓊脂平板,按GB4789.28中3.7條配制

      2采樣(空氣沉降法)

      2.1布點:面積小于30平方米的車間,設一對角線,在線上取3點,即中心一點,兩端在距墻1米處各取一點;面積大于30平方米的車間,設東、西、南、北、中5個點,其中東、西、南、北點均距墻1米。

      2.2采樣高度:與地面垂直高度80-150厘米。

      2.3采樣方法;用直徑為9厘米的普通營養瓊脂平板在采樣點上暴露20分鐘蓋上送檢培養。

      3培養:于37℃培養24小時。

      4檢測頻率:每周

      空氣質量標準:

      生車間、熟車間、成品車間:低于100個

      半成品庫、成品庫:低于10個

      二、設備的采樣與檢驗方法

      根據生產過程所要求的重點衛生部位,實驗室對其進行涂抹采樣,進行細菌總數檢驗。

      1采樣方法

      1.1涂抹法(適用于表面平坦的設備和工器具產品接觸面)

      取經過滅菌的鋁片框(框內面積為50平方厘米)放在需檢查的部位上,用無菌棉球蘸上無菌生理鹽水擦拭鋁片中間方框部分,擦完后立即將棉球投入盛有10毫升無菌生理鹽水的試管中,此液每毫升代表5平方厘米。

      1.2貼紙法(適用于表面不平坦的設備和工器具接處面)

      將無菌規格紙(5×5厘米,紙質要薄而軟)用無菌生理鹽水泡濕后,于需測部分分別貼上兩張,兩張紙面積共50平方厘米,然后取下放入盛有10毫升無菌生理鹽水的試管中,此液每毫升代表5平方厘米。

      2檢驗方法

      2.1細菌總數的檢驗

      將上述樣液充分振搖,根據衛生情況,相應地做10倍遞增稀釋,選擇其中2-3個合適的稀釋度作平皿傾注培養,培養基用普通營養瓊脂,每個稀釋度作2個平皿,每個平皿注入1毫升樣液,于37℃培養24小時后計菌落數。

      結果計算

      表面細菌總數(cfu/cm2)=平皿上菌落的平均數×樣液稀釋倍數/30×2

      2.2致病菌的檢驗

      沙門氏菌,參照GB4789.4進行

      金黃色葡球菌,參照GB7918.5進行

      4.檢驗合格標準:細菌總數10-100個∕cm2,

      5.關鍵點:細菌總數≤10個∕cm2

      一般區域:細菌總數≤100個∕cm2

      三、人員手表面細菌污染情況的檢驗

      1. 采樣方法:用一支蘸有無菌生理鹽水的棉拭子涂擦被檢對象手的全部,反復兩次,涂擦的時候棉拭子要相應地轉動,擦完后,將手接觸部分剪去,將棉拭子放入裝有10毫升無菌生理鹽水的試管內送檢培養。

      2. 檢驗方法:同工器具表面細菌總數檢驗方法。

      3. 結果計算:每只手表面的細菌總數(cfu/只手)=平皿上菌落的平均數×樣液稀釋倍數

      四、消毒液藥效的微生物學鑒定法

      1采樣對象:正常使用的消毒液,和已知配制好備用的消毒液

      2采樣及檢驗方法

      在無菌條件下,用無菌吸管吸取1毫升樣液,加入9毫升稀釋液中混勻,對于醇類與酚類消毒劑,稀釋液用普通營養肉湯即可;對于含氯消毒劑、含碘消毒劑,需在肉湯中加入0.1%硫代硫酸鈉,對洗必泰、季銨鹽類消毒劑,需在肉湯中加入3%(W/V)土溫80和0.3%卵磷脂;對醛類消毒劑,需在肉湯中加入0.3%甘氨酸;對于含有表面活性劑的各種復方消毒劑,需在肉湯中加入(W/V)土溫80,以中和被檢樣液中的殘效作用,

      將注入了樣液的稀釋液充分搖勻,取1毫升注入平皿,隨之倒入普通營養瓊脂,待瓊脂凝固后,翻轉平皿,將平皿于37℃條件下培養24小時后計平板上生長的菌落數。

      3結果分析

      平板上有菌生長,表明被檢樣液中有殘存活菌,若每個平板菌落數在10個以下,仍可用于消毒,若每個平板菌落數超過10個,說明每毫升被檢樣液含菌量已超過100個,即不宜在用于消毒。

      該公式是一個經驗公式.它的理論模式依據是:100CM2的面積上10MIN降落的菌落數,

      等于1升空氣中所含的細菌總數.系數50000基于上述假說和單位換算而來.

      細菌總數(CFU/M3)=5/10T*100/A*1000*N=50000*N/AT

      5/10T:實際放置了5MIN;

      100/A:A單一培養皿面積;

      1000:1M3=1000L啊,換算成m3

      1、空氣細菌落菌數單位既然是cfu/m3,那采樣時應該還要記錄放置平皿的高度。

      2、食品安全管理體系中罐頭行業有個標準如下:

      落下菌數 空氣污染程度 評價

      30以下 清潔 安全

      30~50 中等清潔

      50~70 低等清潔 應加注意

      70~100 高度污染 對空氣要進行消毒

      100以上 嚴重污染 禁止加工

      3、是否可根據企業相應的加工產品微生物指標進行自行制定?

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